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RNA制剂及在CIK细胞培养方面的应用

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RNA 制剂 CIK 细胞培养 方面 应用
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1、2-3d进行换液, 并 补充等量的RNA制剂和INF-。 说明书 3/4 页 5 CN 107129入 INF-(1000U/mL), 并于24h后添加实施例4制备的RNA制剂(50 g/mL), 每。 0056 对比组: 调整悬浮细胞密度至1106/ml, 在完全培养基(1640+10FBS)中加施例3制备的RNA制剂(50 g/mL), 每2-3d进行换液, 并 补充等量的RNA制剂和INF-l, 在完全培养基(1640+10FBS)中加入 INF-(1000U/mL), 并于24h后添加实行换液, 并 补充等量的RNA制剂和INF-。 0055 实验组C: 调整悬浮细胞密度至1106/m。

2、-(1000U/mL), 并于24h后添加实施例2制备的RNA制剂(50 g/mL), 每2-3d进 实验组B: 调整悬浮细胞密度至1106/ml, 在完全培养基(1640+10FBS)中加入 INFRNA制剂(50 g/mL), 每2-3d进行换液, 并 补充等量的RNA制剂和INF-。 0054培养基(1640+10FBS)中加入 INF-(1000U/mL), 并于24h后添加实施例1制备的组A-C、 对比组、 阳性对照组。 0053 实验组A: 调整悬浮细胞密度至1106/ml, 在完全悬细胞后置于37, 5CO2孵箱中孵育2h。 0052 收集单核细胞中的悬浮细胞, 分成5组: 实验。

3、分离液上层, 650g, 4离心20min, 收集白色细胞层, 分离单个核细胞, 1640培养基 重 单个核细胞的分离: 采集健康志愿者外周血20mL, 预冷的PBS 1:1稀释, 缓慢加入 淋巴细胞K细胞杀瘤活性的影响 0049 一、 实验方法 0050 1、 CIK细胞的原代培养和分组 0051明, 总RNA完好未降解, 电泳结果与实施例1基本相同。 0048 实施例5: 效果实施例, 对CI47 与实施例1相比, 除总RNA提取之前不进行35CO2孵育刺激外, 其他完全相同。 检 测结果证总RNA完好未降解(如图1C所示)。 0046 实施例4: RNA制剂的制备, 与实施例1对比 00。

4、0之间, 1.2琼脂糖电泳可见28s、 18s和5s三条带, 其中28s的亮度是18s的2倍, 提示NA抽提试剂盒提取的成熟DC总RNA, 经分光光度计检测, OD260/OD280 介于1.8-2.脂糖电泳检测RNA完整性, -80冻存备用。 0044 三、 实验结果 0045 用Trizol总R取总RNA, 经分光光度计检测OD260值及OD260/ OD280, 计算总RNA含量和纯度, 琼置于37、 25CO2孵育箱中培养4小时。 4小 时后, 按照Trizol总RNA抽提试剂盒说明书提熟(100ng/mL), 连续培养7d。 0043 3、 总RNA提取: 提取前4小时, 将成熟DC。

5、2天半量换液一次, 换液后补充GM-CSF、 IL-4, 于第6d在培养基中添加TNF- 诱导DC成00U/mL)、 IL-4(1000U/mL)诱导DC生成, 于37、 5CO2 孵育箱中培养, 每 单个核细胞培养2h后收集贴壁细胞, 在完全培养 基(1640+10FBS)中添加GM-CSF(10养 基重悬细胞后置于37、 5CO2孵箱中孵育2h。 0042 2、 树突状细胞(DC细胞)的培养:淋巴细胞分离液上层, 650g, 4离心20min, 收集白色细胞层, 分离单个核细胞, 1640培1 1、 单个核细胞的分离: 采集健康志愿者外周血20mL, 预冷的PBS 1:1稀释, 缓慢加 入。

6、 0039 RPMI-1640培养基和胎牛血清均为Gibco产品。 0040 二、 实验方法 004总RNA抽提试剂盒, Invitrogen, 购于Thermo Fisher Scientific。7 一、 实验材料 说明书 2/4 页 4 CN 107129984 A 4 0038 Trizols的2倍, 提示总RNA完好未降解(如图1B所示)。 0036 实施例3: RNA制剂的制备 003介于1.8-2.0之间, 1.2琼脂糖电泳可见28s、 18s和5s三条带, 其中28s的亮度是18Trizol总RNA抽提试剂盒提取的成熟DC总RNA, 经分光光度计检测, OD260/OD280 。

7、含量和纯度, 琼脂糖电泳检测RNA完整性, -80冻存备用。 0034 三、 实验结果 0035 用提试剂盒说明书提取总RNA, 经分光光度计检测OD260值及OD260/ OD280, 计算总RNA时, 将成熟DC置于37、 45CO2孵育箱中培养2小时。 2小 时后, 按照Trizol总RNA抽F- 诱导DC成熟(100ng/mL), 连续培养7d。 0033 3、 总RNA提取: 提取前2小育箱中培养, 每2天半量换液一次, 换液后补充GM-CSF、 IL-4, 于第6d在培养基中添加TNM-CSF(1000U/mL)、 IL-4(1000U/mL)诱导DC生成, 于37、 5CO2 孵。

8、C细胞)的培养: 单个核细胞培养2h后收集贴壁细胞, 在完全培养 基(1640+10FBS)中添加G胞, 1640培养 基重悬细胞后置于37、 5CO2孵箱中孵育2h。 0032 2、 树突状细胞(D释, 缓慢加 入淋巴细胞分离液上层, 650g, 4离心20min, 收集白色细胞层, 分离单个核细实验方法 0031 1、 单个核细胞的分离: 采集健康志愿者外周血20mL, 预冷的PBS 1:1稀entific。 0029 RPMI-1640培养基和胎牛血清均为Gibco产品。 0030 二、 8 Trizol总RNA抽提试剂盒, Invitrogen, 购于Thermo Fisher Sci。

9、好未降解(如图1A所示)。 0026 实施例2: RNA制剂的制备 0027 一、 实验材料 0021.2琼脂糖电泳可见28s、 18s和5s三条带, 其中28s的亮度是18s的2倍, 提示总RNA完剂盒提取的成熟DC总RNA, 经分光光度计检测, OD260/OD280 介于1.8-2.0之间, 测RNA完整性, -80冻存备用。 0024 三、 实验结果 0025 用Trizol总RNA抽提试, 经分光光度计检测OD260值及OD260/ OD280, 计算总RNA含量和纯度, 琼脂糖电泳检 35CO2孵育箱中培养3小时。 3小 时后, 按照Trizol总RNA抽提试剂盒说明书提取总RNA。

10、ng/mL), 连续培养7d。 0023 3、 总RNA提取: 提取前3小时, 将成熟DC置于37、液一次, 换液后补充GM-CSF、 IL-4, 于第6d在培养基中添加TNF- 诱导DC成熟(100L)、 IL-4(1000U/mL)诱导DC生成, 于37、 5CO2 孵育箱中培养, 每2天半量换胞培养2h后收集贴壁细胞, 在完全培养 基(1640+10FBS)中添加GM-CSF(1000U/m细胞后置于37、 5CO2孵箱中孵育2h。 0022 2、 树突状细胞(DC细胞)的培养: 单个核细离液上层, 650g, 4离心20min, 收集白色细胞层, 分离单个核细胞, 1640培养 基重悬。

11、单个核细胞的分离: 采集健康志愿者外周血20mL, 预冷的PBS 1:1稀释, 缓慢加 入淋巴细胞分 RPMI-1640培养基和胎牛血清均为Gibco产品。 0020 二、 实验方法 0021 1、 提试剂盒, Invitrogen, 购于Thermo Fisher Scientific。 0019页 3 CN 107129984 A 3 0017 一、 实验材料 0018 Trizol总RNA抽材料, 属于本领域技术人员易于获得的范畴。 0016 实施例1: RNA制剂的制备 说明书 1/4 地解释本发明的技术方案, 下面结合具体实施例进一步介绍。 实施例中 未特别强调的实验材料均为常规实验。

12、7721细胞的杀伤率(A为效靶比10:1, B为效靶比20:1)。 具体实施方式 0015 为了更好图(A、 B、 C分别对应实施例1-3制备的总RNA); 0014 图2为各组CIK细胞对SMMC-较高的外源性细胞因子, 提高培养便捷性, 降低成本。 附图说明 0013 图1为DC细胞总RNA电泳本发明提供的RNA制剂可以用于诱导制备具有高效杀瘤活性的CIK细胞, 可以用于 替代组合复杂、 成本小时。 0010 上述RNA制剂在培养扩增CIK细胞方面的应用。 0011 本发明优点: 0012 优选地, 高浓度指CO2占空气体积分数25-45。 0009 优选地, 高浓度CO2刺激时间为2-4。

13、RNA之前, 对树 突状细胞进行高浓度CO2刺激; 所述高浓度指CO2占空气体积分数5。 0008 下技术方案得以实现: 0007 一种RNA制剂, 为树突状细胞的总RNA, 在提取所述树突状细胞的总杂、 成本较高的外源性细胞因 子, 以诱导制备具有高效杀瘤活性的CIK细胞。 0006 本发明通过如外源性细胞因子进行诱导刺激。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种RNA制剂, 以替代组合复提高CIK细胞毒活性、 增强对肿瘤细胞杀伤的关键。 0004 现有技术通常都是通过在培养基中添加多种 0003 CIK细胞的增殖和细胞毒活性依赖于培养条件的刺激。 培养高纯度CD3+CD56+细胞 是。

14、活性, 另一方面还拥有NK细胞非 MHC限制性的杀伤肿瘤的特点, 其增殖迅速、 对正常造血影响轻微。表型T淋巴细胞, 兼有NK细胞和T细胞的 特征。 在功能上, CIK一方面拥有T淋巴细胞强大的抗肿瘤作用微小等优点, 已经成为肿瘤生物免疫治 疗的主力军。 CIK细胞的主要效应细胞为CD3+CD56+ CIK)是近年来发现的一种非常有前景的过继免疫细 胞, 具有增殖迅速、 杀瘤活性广谱且高效、 毒副日益受到重视。 细胞因子诱导的杀伤细 胞(cytokine-induced killer cell,RNA制剂及在CIK细胞培养 方面的应用。 背景技术 0002 肿瘤的生物免疫治疗作为第四种治疗手段。

15、IK细胞培养方面的应用 技术领域 0001 本发明属于细胞免疫领域, 涉及CIK细胞, 具体涉及一种细胞方面的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107129984 A 2 一种RNA制剂及在C特征在于: 高浓度CO2刺激时间为2-4小时。 4.权利要求1-3任一所述RNA制剂在培养扩增CIK, 其特征在于: 高浓度指CO2占空气体积分数25-45。 3.根据权利要求2所述的RNA制剂, 其细胞进行高浓度CO2刺激; 所述高浓度指CO2占空气体积分数5。 2.根据权利要求1所述的RNA制剂NA制剂, 为树突状细胞的总RNA, 其特征在于: 在提取所述树突状细胞的总RNA 之前, 对树突状。

16、图1页 CN 107129984 A 2017.09.05 CN 107129984 A 1.一种R合复杂、 成本较高的外源性细胞因子, 提高培 养便捷性, 降低成本。 权利要求书1页 说明书4页 附体 积分数5。 本发明提供的RNA制剂可用于诱导 制备具有高效杀瘤活性的CIK细胞, 可用于替代 组NA, 在提取树突状细胞的总RNA之前, 对树突状 细胞进行高浓度CO2刺激, 高浓度指CO2占空气)摘要 本发明公开了一种RNA制剂及在CIK细胞培 养方面的应用, 该RNA制剂为树突状细胞的总 R5/0783(2010.01) (54)发明名称 一种RNA制剂及在CIK细胞培养方面的应用 (57发明人 胡攀勇张钟祥黄欣 (51)Int.Cl. C12N 15/10(2006.01) C12N 南京佰泰克生物技术有限公司 地址 211505 江苏省南京市六合区中山科 技园科创大道9号 (72)(21)申请号 201710360702.4 (22)申请日 2017.05.22 (71)申请人 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日。

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本文标题:RNA制剂及在CIK细胞培养方面的应用
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